北京大学陈鹏、王初最新Cell：开发蛋白质活体“激活”技术
发展复杂生命系统中的蛋白质原位研究技术，是揭示生命过程与理解疾病机制的关键途径。2025年5月27日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心陈鹏课题组与王初课题组，合作报道了一种活体动物中通用的蛋白质特异-可控激活技术CAGE-Proxvivo，相关成果以 Machine-learning-assisted universal protein activation in living mice 为题在Cell杂志在线发表。早在2019年，两个课题组就在Nature杂志合作报道了普适性的蛋白质原位激活技术CAGE-Prox，可以在细胞内对目标蛋白质实现瞬时、特异性激活，为动态解析蛋白质作用机制提供了全新策略（Nature,2019, 569, 509-513）。然而该方法依赖于紫外光照，存在组织穿透力不足等局限性，使其在活体动物上的应用受到制约。因此，在活体动物中实现高效精准的蛋白质调控技术，成为领域内亟待解决的问题。在最新的工作中，作者通过机器学习辅助设计，成功将一种“化学保护开关”引入目标蛋白，使蛋白质功能暂时关闭，并通过小分子诱导的生物正交剪切反应在体内原位恢复蛋白质功能，实现可控激活（图1）。这一全新的蛋白质功能调控技术，还可以实现活体动物中蛋白质–蛋白质相互作用的精确调控。借助CAGE-Proxvivo，作者实现了细胞表型的精准调控，可控诱导肿瘤细胞发生焦亡（pyroptosis），以增强抗肿瘤免疫响应。此外，作者还设计了一种“门控型”双特异性抗体，在肿瘤部位实现T细胞的靶向招募与激活，展示了CAGE-Proxvivo在肿瘤免疫治疗中的应用潜力。
图1.机器学习驱动的蛋白质活体激活通用策略01“邻近激活”技术的升级换代
相比于紫外光控脱笼，化学脱笼应用范围更广，尤其是适用于活体动物内的生物大分子调控。例如，逆电子需求Diels-Alder反应（IEDDA），即反式环辛烯（TCO）与四嗪（Tz）之间的反应，显示出极好的效率和与活体动物的兼容性，是体内常用的高效生物正交剪切反应。若能将该反应拓展用于酪氨酸（Tyr）的脱保护，则可将CAGE-Prox升级为适用于活体动物的通用蛋白激活平台。这一策略的关键在于成功演化出能识别并加载体积较大、可脱保护的反式环辛烯-酪氨酸（TCOY）的氨酰tRNA合成酶（PylRS）突变体，这在技术上极具挑战。作者首先尝试了已有的上百个tRNA合成酶突变体，结果都无法识别这个新型的非天然氨基酸，接着使用基于结构的蛋白质与小分子建模方案对PylRS与TCOY的复合物进行能量优化也未能成功。通过对已知的PylRS突变体与对应的底物建模发现，可以识别的配对在总结合能上并没有明显的优势。作者推测过度优化蛋白与底物间的作用可能使得PylRS活性由于产物无法释放而被抑制。正在研究陷入困境时，基于大量天然蛋白质序列的“蛋白语言模型”，随着人工智能领域的技术突破取得重要进展，展示出利用小样本甚至零样本完成下游预测任务的能力。这提示语言模型可以学到与酶活性相关的关键信息，但这些信息与底物类型无关，难以直接迁移到全新的底物。于是作者采取了一种新颖的整合策略，把基于结构的各种能量信息和基于序列的编码以及打分信息拼接在一起，进行传统的监督学习，成功得到两个具有识别TCOY能力的突变体（图2）。为了进一步挑战模型的边界，作者还合成了反式环辛烯-半胱氨酸（TCOC），选择可以识别反式环辛烯-赖氨酸（TCOK）的PylRS突变体作为起点，同样成功获得了两个具有识别TCOC能力的突变体。
图2.机器学习辅助的氨基酸tRNA合成酶进化过程示意图虽然该机器学习的训练集是针对类似酪氨酸的衍生物收集的，但目前的结果表明该模型也具有一定的泛化能力，作者认为蛋白语言模型更倾向于保持酶的基本活性，而能量模型则能排除破坏底物结合的突变。如果未来能进一步扩大训练集中非天然氨基酸类型，增加训练集样本数量，并引入更先进的机器学习模型训练方式以及更先进的突变体优化策略，这一方法将有望应用于更广泛的非天然氨基酸识别场景。此外，传统的“邻近脱笼”是针对目标蛋白中的底物结合口袋进行调控。通过统计分析，作者发现酪氨酸除了在蛋白-小分子结合口袋之外，在蛋白-蛋白相互作用的界面也具有较高的丰度，基于酪氨酸类似物的非天然氨基酸在调控蛋白-蛋白互作界面中也表现优异。因此，在CAGE-Prox的结构建模流程上进行简单的调整，即可成功地将该激活技术扩展至活体动物内的蛋白-蛋白互作调控。02CAGE-Proxvivo技术的应用
在建立CAGE-Proxvivo标准流程后，作者将其应用于蛋白质靶向递送与免疫治疗，结合广泛应用的LF-PA递送系统，成功实现了在活体小鼠中对炭疽致死因子（LF）的精准激活。首先通过化学“开关”暂时关闭LF蛋白的功能，随后利用携带靶向分子的保护性抗原EGF-PA蛋白将其精准递送至特定细胞。通过活体中的生物正交剪切反应，LF活性得以原位恢复，选择性诱导癌细胞死亡（图3A）。这一策略巧妙结合了靶向递送与化学激活的双重控制，构建了一个可控的蛋白前药系统，实现了小鼠体内LF功能的精确激活和癌细胞杀伤，有效抑制肿瘤生长。利用CAGE-Proxvivo，作者还在活体动物中实现了肿瘤特异细胞焦亡（pyroptosis）的可控诱导。细胞焦亡是一种由Caspase介导的细胞死亡方式，因其炎症特性而在抗肿瘤免疫中具有潜力。尽管传统化疗药物可诱导细胞焦亡，但因GSDME在许多肿瘤细胞中的表达较低，开发肿瘤特异性细胞焦亡的方法仍面临挑战。通过EGF-PA介导的靶向递送与生物正交激活机制，LF被有效递送至小鼠肺癌LLC细胞，并通过Caspase-3依赖性GSDME切割诱导细胞焦亡，有效抑制了继发肿瘤的生长（图 3B）。此外，结合DNA甲基化抑制剂可恢复GSDME表达，进一步扩大了这一策略的适用范围，有望实现在多种肿瘤细胞中的焦亡诱导。总体而言，CAGE-Proxvivo通过实现肿瘤特异性焦亡的按需诱导，为深入研究其机制提供了简便而有效的手段，也为将免疫原性低的“冷”肿瘤转变为高免疫原性的“热”肿瘤提供了新的策略。尽管T细胞接合器（T cell engagers，TCEs）在血液癌症治疗中已获得临床验证，但其在实体瘤中的应用仍未得到广泛认可，主要原因在于频繁引发系统性细胞因子释放综合征（CRS）及其靶向和非靶向肿瘤的毒性。因此亟需一种更安全的TCE疗法，能够在肿瘤局部精确激活肿瘤抗原特异性T细胞。为此，作者们基于CAGE-Proxvivo策略调控蛋白-蛋白相互作用的能力，开发了一种生物正交“门控”双特异性抗体，用于按需招募和激活T细胞。通过将TCOY引入抗CD3抗体（aCD3），并将其与肿瘤靶向模块（如HER2靶向的双特异性抗体“ZHER2-aCD3”）结合，构建了具有条件性激活能力的“开关”型TCE（图 3C）。实验结果表明，这种抗体在体内能够通过正交剪切反应恢复T细胞活性，避免广泛的细胞因子释放及相关毒性，从而显著提高治疗的安全性。这一基于生物正交化学的前体激活策略，为肿瘤免疫治疗中的靶向递送和T细胞特异性激活提供了新的途径。
图3.CAGE-Proxvivo技术：蛋白质活体原位激活通用平台综上所述，陈鹏课题组与王初课题组合作开发的CAGE-Proxvivo技术是一种创新的普适性蛋白质功能调控策略，通过结合机器学习与结构建模方法，能够在活体动物中按需激活蛋白质功能，并精确调节蛋白-蛋白相互作用。CAGE-Proxvivo不仅可以特异性激活目标蛋白，还能够调节细胞表型，诱导肿瘤细胞发生焦亡，从而增强抗肿瘤免疫反应。此外，CAGE-Proxvivo在肿瘤免疫治疗中展现了重要潜力，成功开发了生物正交“门控”双特异性抗体，用于按需招募和激活T细胞，有效避免了系统性细胞因子释放综合征。这一高效、通用的平台为生命科学研究和精准医学提供了全新的技术支撑，具有广泛的应用前景，能够推动疾病机制研究和靶向治疗策略的发展。https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(25)00517-3青科沙龙第155期：人源化猪模型与人源细胞/器官再造，嘉宾：胡正（吉林大学第一医院教授、博士生导师）
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